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Etude Des Mécanismes De Déméthylation De L'Adn Par Mbd4

Reference : PhD Christian Bronner

Publication de l'offre : 14 mars 2017

La méthylation de l'ADN est l'une des marques épigénétiques majeures impliquée dans de nombreux processus physiologiques, tels que l'inactivation du chromosome X, le maintien de l'intégrité du génome et l’empreinte génomique parentale. Plus précisément, la méthylation de l'ADN est
intimement associée à la répression des gènes. Des profils de méthylation de l'ADN aberrants sont retrouvés dans de nombreuses maladies, comme le cancer et les troubles neuro-dégénératifs. Contrairement à la méthylation de l'ADN, qui
est maintenant relativement bien compris, les mécanismes de déméthylation de l'ADN restent mal connus. Toutefois, très récemment la déméthylation de l'ADN a gagné en attractivité grâce à la découverte de nouveaux analogues de la cytosine à savoir la 5-hydroxy-méthyl-cytsine, la 5 formylcytosine et la 5-
carboxyl-cytosine.

 

Nos résultats préliminaires indiquent que la protéine MBD4 humaine (Methyl Binding Domain 4) participe à la déméthylation active de l'ADN, mais les bases moléculaires de ce mécanisme restent encore à étudier. MBD4 est une ADN glycosylase qui a la capacité d'exciser une base non complémentaire de l'ADN,
créant ainsi un site abasique. Nous cherchons à comprendre le rôle de MBD4 dans la méthylation de l'ADN et la régulation de la transcription. Plus précisément, nous voulons comprendre les relations entre l'organisation nucléosomale de promoteurs de gènes, les variants d’histones, la déméthylation de l'ADN, et MBD4.

 

Premièrement, nous allons caractériser précisément les partenaires protéiques de MBD4, et nous allons étudier l'effet de ces partenaires sur l'activité de MBD4. Pour cela, nous allons générer des lignées de cellules HeLa stables, exprimant MBD4 doublement marqué (HA et FLAG)-MBD4 (e-MBD4) et nous
allons purifier le complexe MBD4 par double affinité en utilisant un protocole bien établi dans notre laboratoire. Après, avoir identifié des partenaires potentiellement intéressants, nous allons les cloner et les sur-exprimer dans les bactéries E. coli pour confirmer, in vitro, l'interaction par des expériences de
GST-pull down. L'interaction de MBD4 avec un partenaire nouvellement identifié sera confirmée in vivo dans la cellule, par immunocytochimie. L’activité glycosylase de MBD4 sera évaluée in vitro en présence et en absence de chacun de ses partenaires que nous aurons identifiés. Ces études biochimiques
sont basées sur l'utilisation d'oligonucléotides radio-marqués et sur l'analyse subséquente par électrophorèse sur gel.

 

Ensuite, nous allons construire plusieurs mutants de MBD4 afin d'identifier les domaines impliqués dans l'interaction de MBD4 avec ses partenaires. Comme précédemment, l'interaction sera estimée par des expériences de GST-pull down. En outre, des mutants de MBD4 seront construits pour caractériser les
rôles des différents domaines d'interaction de MBD4 dans son activité glycosylase. Nous allons muter certains acides aminés situés dans le domaine glycosylase (partie C-terminale) et certains acides aminés du domaine de liaison à l'ADN (partie N-terminale).

 

Ces données seront utilisées, par la suite, pour réaliser des études structurales des complexes formés entre MBD4 et certains de ses partenaires, et donc pour comprendre, en termes moléculaires, l'activité de ces complexes. En outre,
nous allons analyser le rôle de l'activité de MBD4 sur la transcription à l’échelle du génome entier. Ce dernier travail va faire appel aux techniques de ChIP-Seq, RNA-Seq et l’analyse du méthylome à partir de cellules exprimant soit MBD4 de
type sauvage ou muté.

 

 

 

 

Compétences & aptitudes souhaitées

Les candidats devront avoir un master ou équivalent. Des connaissances en biologie moléculaire, en biochimie et/ou cellulaires sont requises.

 

Nous utilisons la technique de TAP-Tag pour purifier les complexes MBD4 et ainsi déterminer l'interactome de MBD4. Le candidat renforcera ses connaissances en biologie moléculaire et cellulaire ainsi qu'au niveau biochimique. Il sera confronté aux techniques de clonage, de PCR, d'immunoytochimie, de
purification de complexes macro-moléculaires, de gene silencing, de westernblot…

Votre candidature

Date limite de candidature : 1 novembre 2017

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