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Application De La Rmn Du Fluor Pour L'Étude Des Mécansimes De Signalisation Par La Phosphorylation Des Récepteurs Nucléaires

Reference : PhD Student

Publication de l'offre : 22 mars 2017

La phosporylation des protéines constitue un mécanisme général par lequel une fonction cellulaire donnée peut être activée ou désactivée par un signal externe. La réaction de phosporylation qui est catalysée par des kinases conduit à la
modification réversible d'acides aminés spécifiques tels que la serine, la thréonine ou la tyrosine. Ce procédé est utilisé dans un grand nombre de voies de signalisation cellulaires intervenant dans la régulation de fonctions cellulaires fondamentales telles que la division cellulaire, l'apoptose ou le métabolisme.

 

Dans les cellules eucaryotes, la régulation de l'expression génique par les récepteurs nucléaires (NR) implique un certain nombre d'événements de phosporylation, en plus de la liaison de l'hormone apparentée au récepteur. C'est le cas des récepteurs non-stéroïdiens tels que le récepteur d'acide rétinoïque (RAR) et des récepteurs stéroïdiens tels que le récepteur aux androgènes (AR). De nombreux sites de phosphorylation sur NR sont situés
dans leurs domaines N-terminaux, intrinsèquement désordonnés dont les affinités de liaison pour des co-régulateurs spécifiques sont modulées par cette modification post-traductionnelle.

 

Le mécanisme moléculaire fondamental sousjacent reste inconnu à ce jour pour plusieurs raisons:

(i) la phosphorylation se produit fréquemment dans des régions désordonnées ce qui ne permet pas l'établissement de relation structure-fonction traditionelles,

(ii) les interactions modulées par la phosphorylation sont souvent faibles,

(iii) les aspects cinétiques doivent être considérés pour comprendre les mécanismes de phosphorylation.

Ces considérations expliquent pourquoi la résonance magnétique nucléaire (RMN) est un outil de choix pour étudier les mécanismes moléculaires liés à la phosphorylation des protéines.

 

Dans ce projet, nous visons à développer une approche NMR originale pour étudier les mécanismes impliqués dans la phosphorylation des récepteurs nucléaires RAR et AR. Cette approche est basée sur l'utilisation du fluor, un noyau qui possède un spin 1/2 et une sensibilité proche de celle du proton. Le fait que le fluor ne soit pas présent dans les biomolécules constitue un moyen intéressant d'observer la réaction de phosphorylation dans des milieux biologiques complexes, tels que des extraits cellulaires.

 

Le projet portera sur des sites de phosphorylation situés dans des régions riches en prolines de récepteurs AR et RAR. En effet, les résidus de proline sont souvent présents dans des sites de reconnaissance des kinases, soit en tant que résidu isolé, soit en tant que séquence polyproline. De plus, des fluoroprolines pourraient être utilisées pour marquer les substrats de kinases et caractériser les conséquences
de la phosphorylation sur la structure du substrat et sur sa dynamique. La nature bio-orthogonale du fluor permet de mesurer la cinétique de réaction de la kinase dans des environnements cellulaires avec une sensibilité et une
spécificité élevées. Les fluoroprolines seront également utilisées pour sonder les effets croisés entre l'isomérisation cis-trans de proline et le signal de phosphorylation, puisque les deux phénomènes sont étroitement liés dans les mécanismes de régulation médiés par les récepteurs nucléaires. La capacité du
fluor à stabiliser les isomères cis ou trans, en fonction de sa position dans le cycle proline, sera particulièrement intéressante pour étudier ce point.

La RMN du fluor et plus particulièrement des fluoroprolines sera utilisée pour répondre spécifiquement aux questions suivantes:

- Dans le cas du NTD de RAR, quel est l'effet de la phosphorylation du S79 sur la conformation de la séquence polyproline adjacente?

- Quelle est la séquence de phosphorylation du RAR NTD par les kinases p38MAPK / MSK1 et Cdk7?

- pour le récepteur AR, Quel est l'effet de la phosphorylation de S81 sur la formation d'agrégats de AR ? Quel est l'impact de la rotamase Pin1 sur ce phénomène ?

Compétences

 

- RMN : connaissances de base
- Biophysique
- biochimie des protéines, biologie structurale

Expertises

 

- expertise en spectroscopie RMN, et en spectroscopie du fluor
- expression, purification des protéines
- outils d'analyse et de simulation en python
- Connaissance de base sur la régulation de l'expression des gènes chez les eucaryotes

Votre candidature

Date limite de candidature : 1 novembre 2017

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