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Rôle De Asf1 Au Cours De La Déposition Des Histones Liée À La Réplication De L’Adn #

Reference : PhD Student

Publication de l'offre : 23 mars 2017

Directeur de Thèse : RAMAIN PHILIPPE

 

INTRODUCTION

 


L'unité de base fondamentale de la chromatine est le nucléosome, composé d’ADN enroulé autour d'un octamère de protéines histones. L'assemblage et le démontage des nucléosomes surviennent au cours des processus dans
lesquels l’ADN est engagé, à savoir la réplication, la réparation, la transcription et la recombinaison. Les acteurs clés de ces processus sont les histones, les chaperons d'histones et les complexes de remodelage de la chromatine.

 


Le projet a pour but d’étudier la fonction des isoformes du chaperon d'histones ASF1 («Anti-silencing factor 1») au cours de la déposition des histones liée à la réplication de l’ADN.

 


1 : Identification des partenaires protéiques de chacune des isoformes de ASF1 dans les cellules de mammifères.
Nous préparerons des extraits nucléaires bruts à partir de lignées de cellules mammifères exprimant l’une des isoformes de ASF1, exprimée sous forme d’une protéine de fusion comportant une étiquette constituée des épitopes Flag et HA. Par la méthode TAP-Tag appliquée à ces extraits, nous purifierons
les complexes protéiques comportant l'isoforme de ASF1. L'isoforme porteuse de l’étiquette sera isolée par double immuno-affinité et les protéines associées à l’isoforme immuno-précipitée seront identifiées par masse spectrométrie.

 

2 : Localisation des sites de liaison des isoformes de ASF1 sur la chromatine Les régions C-terminales des isoformes sont divergentes et sont probablement impliquées dans la liaison de partenaires spécifiques responsables des spécificités fonctionnelles. Les polypeptides correspondants aux domaines Cterminaux des isoformes seront utilisés pour immuniser les animaux (lapin, souris) dans le but de générer des anti-corps spécifiques. La localisation des sites de liaison des isoformes sera précisément étudiée au niveau du génome complet par immunoprécipitation de la chromatine et analyse de la séquence
des fragments d’ADN associés à la chromatine immunoprécipitée. Comme l’obtention d’anticorps spécifiques demeure hasardeuse, nous pourrons également utiliser les lignées cellulaires exprimant les isoformes porteuses de l’étiquette Flag-HA et utiliser les anticorps anti-Flag et anti-HA
pour réaliser l’immunoprécipitation de la chromatine.

 

3 : Analyse des interactions moléculaires entre les isoformes de ASF1 et les partenaires protéiques dans des cellules hétérologues telles que la bactérie ou les cellules sF9 d’insectes infectées par le baculovirus Nous étudierons les interactions moléculaires entre les isoformes de ASF1 et les partenaires à l’aide d’extraits protéiques préparés à partir de bactéries ou
de cellules d’insectes sF9 infectées par les baculovirus et dans lesquelles les partenaires sont co-exprimés.

 

4 : Analyse des interactions entre les isoformes de ASF1 et des partenaires spécifiques de chacune d’entre elle par cristallisation. L’expression simultanée des protéines dans la bactérie ou dans les cellules d’insectes nous permettra d’identifier les domaines nécessaires à l’interaction entre isoformes et partenaires. Nous pourrons en collaboration avec les équipes de l’institut spécialistes en cristallisation décrypter plus finement la nature de ces interactions.

 

5 : Reconstitutions de systèmes in vitro permettant de reproduire les activités des isoformes de ASF1.

 

Compétences

 

Les candidats devront avoir un master ou équivalent. Des connaissances en biologie moléculaire, en biochimie et/ou cellulaires sont requises.

 

Expertises

 

*Biologie Moléculaire (Manipulation de l'ADN. Constructions de vecteurs d'expression des protéines. Analyse de l'expression des protéines ).
*Culture Cellulaire.
*Biochimie (préparation d'extraits protéiques. Purifications de complexes multiprotéiques).
*Analyse des interactions moléculaires entre protéines (Immuno-précipitation.
Immuno-cytochimie. Co-expression de protéines dans la bactérie ou dans des cellules d'insectes).
*Analyse bio-informatique

Votre candidature

Date limite de candidature : 1 novembre 2017

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